1.
Introducción
La mora de castilla (Rubus glaucus) originaria de la región Andina constituye un frutal de alta importancia económica en Ecuador, debido a la demanda creciente y la rentabilidad del cultivo (INIAP, 2016). Actualmente, este fruto tiene potencial de exportación tanto fresco como transformado en productos alimenticios, industrialmente (Saltos, 2001). Su consumo se diversifica desde fruta fresca hasta la elaboración de productos con valor agregado como mermeladas, pulpas, colorantes, entre otros. En Ecuador, el cultivo de la mora de castilla se encuentra ubicado a lo largo del Callejón Interandino, a una altitud de 1200 y 3000 msnm (Bejarano, 1992); y, de acuerdo con datos publicados por el MAGAP (2013), el 70 % de la producción nacional se encuentra en la provincia de Tungurahua.
Debido a los cambios bruscos de temperatura, el cultivo de la mora tiene alta susceptibilidad a las afecciones de origen fúngico, de estas la más relevante es el pie negro. El agente causal del pie negro de la mora de Castilla estaba identificado como Cylindrocarpon destructans, pero recientemente se determinó que la enfermedad es causada por un grupo de hongos de los géneros Ilyonectria y Dactylonectria, incluido el Dactylonectria torresensis, hongo mitospórico cuya característica es la presencia de fiálidas largas y conidios hialinos (Sánchez et al., 2019).
El pie negro de la mora es una enfermedad que se identifica por la reducción del vigor, necrosis en el tejido vascular, clorosis, pudrición del cuello y raíces y ausencia de brotes en la planta; puede además causar la muerte de la planta (Leiva, 2011). La incidencia y severidad de esta afección han generado cambios en cuanto al manejo fitosanitario en el cultivo de la mora, que lo hace más agresivo y constante (Alarcón, J., Garrido, L., y Leiva, L. , 2011).
Esta práctica ha causado el incremento del uso de agroquímicos para manejar los cultivos convencionales y evitar la merma producida por este patógeno (Martínez, 2014). Sin embargo, esto ha incidido de forma perjudicial en la cadena de valor de la mora, lo que causa que el fruto llegue al mercado con altos contenidos de residuos de agroquímicos, y que se reduzcan las oportunidades de exportación por no alcanzar los parámetros mínimos exigidos a nivel internacional (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, 2008).
En este marco, se están generando esfuerzos en el ámbito de la investigación en laboratorio y en campo como aporte para proponer alternativas viables, funcionales y económicas a los productores con el fin de obtener cultivos inocuos con base en una ‘agricultura limpia’.
Devia (2011) define la agricultura limpia como “[...] una forma de producción agropecuaria que aplica procedimientos especiales que buscan proteger la naturaleza y sus especies”. Actualmente, el auge del consumo más saludable se ha incrementado a nivel mundial, y existe una concienciación sobre reducir químicos en toda la gama alimenticia desde la producción de materia prima. Por esta razón, el objetivo de la investigación fue evaluar, en condiciones controladas de laboratorio, la eficiencia de fungicidas de origen orgánico frente a fungicidas de síntesis química de uso convencional, para controlar el crecimiento micelial del hongo Dactylonectria torresensis, aislado de la mora de castilla producida en la provincia de Tungurahua.
Como hipótesis se estableció que al menos un fungicida orgánico presenta eficiencia in vitro semejante a los fungicidas químicos para controlar el hongo.
2. Metodología
La investigación tomó lugar en el laboratorio de Fitopatología del Departamento de Protección Vegetal del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en Quito, Ecuador, en condiciones de altitud de 3058 msnm, longitud 78°33′O y latitud 00°22′S.
El estudio se desarrolló en dos etapas. La primera sirvió para la evaluación in vitro del efecto fungistático de cada uno de los productos evaluados, y el efecto sobre la capacidad esporulación del hongo Dactylonectria torresensis en condiciones controladas de humedad del 80 %, temperatura de 18 °C y sin luz. En la segunda etapa se consideró calcular la concentración efectiva (EC50) del agroquímico de interés.
En la investigación se aplicó un diseño al azar en arreglos factoriales de 10x3+1 para los tratamientos con productos de síntesis química, y 5x3+1 para los de síntesis orgánica. Se obtuvo un total de 47 tratamientos correspondientes a las interacciones de los factores más un testigo absoluto, con diez repeticiones para cada uno. Estos tratamientos se describen en las tablas 1 y 2:
Tabla 1.
Descripción de los tratamientos de estudio para evaluar los fungicidas de síntesis química
|
Codificación
|
Fungicida
|
Dosis ppm
|
|
c1d1
|
Benomil
|
1
|
|
c1d2
|
Benomil
|
10
|
|
c1d3
|
Benomil
|
100
|
|
c2d1
|
Carbendazim
|
1
|
|
c2d2
|
Carbendazim
|
10
|
|
c2d3
|
Carbendazim
|
100
|
|
c3d1
|
Fosetyl Aluminio
|
1
|
|
c3d2
|
Fosetyl Aluminio
|
10
|
|
c3d3
|
Fosetyl Aluminio
|
100
|
|
c4d1
|
Metalaxil
|
1
|
|
c4d2
|
Metalaxil
|
10
|
|
c4d3
|
Metalaxil
|
100
|
|
c5d1
|
Thiabendazole
|
1
|
|
c5d2
|
Thiabendazole
|
10
|
|
c5d3
|
Thiabendazole
|
100
|
|
c6d1
|
Difeconazol
|
1
|
|
c6d2
|
Difeconazol
|
10
|
|
c6d3
|
Difeconazol
|
100
|
|
c7d1
|
Himexazol
|
1
|
|
c7d2
|
Himexazol
|
10
|
|
c7d3
|
Himexazol
|
100
|
|
c8d1
|
Propiconazol
|
1
|
|
c8d2
|
Propiconazol
|
10
|
|
c8d3
|
Propiconazol
|
100
|
|
c9d1
|
Penconazol
|
1
|
|
c9d2
|
Penconazol
|
10
|
|
c9d3
|
Penconazol
|
100
|
|
c10d1
|
Azoxystrobin
|
1
|
|
c10d2
|
Azoxystrobin
|
10
|
|
c10d3
|
Azoxystrobin
|
100
|
|
Testigo absoluto
|
No contiene
|
n/a
|
Fuente: INIAP, 2016.
Tabla 2.
Descripción de los tratamientos de
estudio para evaluar los fungicidas de síntesis orgánica
|
Codificación
|
Fungicida
|
Dosis ppm
|
|
a1d1
|
Extracto
de mirtáceas
|
1000
|
|
a1d2
|
Extracto de mirtáceas
|
2000
|
|
a1d3
|
Extracto de mirtáceas
|
3000
|
|
a2d1
|
Aceite
de neem
|
1000
|
|
a2d2
|
Aceite de neem
|
2000
|
|
a2d3
|
Aceite de neem
|
3000
|
|
a3d1
|
Sulfato
cúprico pentahidratado
|
1000
|
|
a3d2
|
Sulfato cúprico pentahidratado
|
2000
|
|
a3d3
|
Sulfato cúprico pentahidratado
|
3000
|
|
a4d1
|
Extracto de ajo
|
1000
|
|
a4d2
|
Extracto de ajo
|
2000
|
|
a4d3
|
Extracto de ajo
|
3000
|
|
a5d1
|
Extracto de tomillo
|
1000
|
|
a5d2
|
Extracto de tomillo
|
2000
|
|
a5d3
|
Extracto de tomillo
|
3000
|
Fuente: INIAP, 2016.
2.1. Aislamiento y purificación de Dactylonectria torresensis
Antes de la evaluación de los fungicidas, se aisló al patógeno tomando muestras del tejido vegetal infectado con una superficie aproximada de 0.5 cm2, las cuales fueron desinfectadas con hipoclorito al 1 %, por 2 minutos, y luego lavadas tres veces con agua destilada esterilizada (ADE). Se colocaron las muestras en cajas de Petri con Potato Dextrose Agar (PDA) para incubarlas a una temperatura de 18 °C, durante un período de siete días, y transcurrido ese tiempo fueron purificadas (Cedeño, Carrero, Quintero, Pino y Espinoza, 2004).
2.2. Manejo de fungicidas y preparación de agares
El manejo del fungicida se llevó a cabo por el método de diluciones en plato de agar (Rondón, Sanabría y Rondón, 2006), en el que se preparó una solución madre concentrada a 1000 ppm con ADE. A partir de esta se dispusieron diluciones específicas de 10 ml mezcladas con 90 ml del medio de cultivo PDA, en condiciones de temperatura de 45 °C. Este medio preparado se dispuso en las cajas de Petri de 9 cm de diámetro (Camele et al., 2012).
Para evaluar la eficiencia del fungicida, se tomaron discos de micelio de 5 mm de diámetro de un cultivo aislado del patógeno y se los depositó en el centro de la caja de Petri. La caja contenía el medio de cultivo más el fungicida de cada uno de los tratamientos, que fueron incubados a 21 °C por períodos de siete y catorce días, para luego medir los diámetros de crecimientos de la colonia en cm (Cedeño et al., 2004).
Para la evaluación estadística, se aplicó la prueba de Tukey al 5 % para fungicida, dosis e interacción.
2.3. Efecto fungistático de los productos evaluados
Se calculó el porcentaje de inhibición mediante el método detallado por Vincent, (1947) que relaciona los datos del crecimiento radial con el control y los datos del crecimiento radial en el tratamiento por medio de la siguiente fórmula:
I=(C-T)*100
C
I= Porcentaje de inhibición,
C= Crecimiento radial del control (cm), y
T= Crecimiento radial del tratamiento (cm)
2.4. Capacidad de esporulación
A partir del tratamiento fungistático, a los catorce días de cultivo fueron recolectadas muestras de 5 mm2 del centro de las cajas de Petri, se las colocó en tubos Eppendorf con 1 ml de ADE y se las expuso a agitación. Finalmente, se contabilizó el número de conidias con un hematocitómetro (Viera, 2002).
2.5. Cálculo del EC50
El EC50 constituye la concentración de los productos que inhibe el crecimiento del patógeno en un 50 %. Esta variable se precisó con la metodología de Probit, que involucra el valor del crecimiento del micelio en porcentaje, y tiene como referente el crecimiento de un testigo absoluto frente a las concentraciones de los tratamientos (Viera, 2002). Para esta evaluación fueron tomados los datos de los siete fungicidas con mayor efectividad en las evaluaciones previas.
3. Resultados
El resultado base del cual proviene la comparativa entre los distintos tratamientos estuvo dado por el crecimiento micelial del testigo absoluto, el cual ha sido considerado en porcentaje al 100 %. De esta estimación fueron obtenidos los resultados subsiguientes detallados a continuación.
3.1. Resultado de la evaluación del efecto fungistático: productos de síntesis química
Esta evaluación reflejó que los resultados obtenidos en el séptimo día de incubación no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos en contraste con los resultados de la toma de muestra al decimocuarto día. En este tiempo la diferencia entre los crecimientos miceliales fue muy evidente, por lo tanto, se corroboró lo citado por (Gaviria-Hernández, Patiño y Saldarriaga, 2013) que el factor tiempo es determinante en cuanto al desarrollo del hongo en el medio de cultivo. En tal virtud, los resultados que se presentan a continuación son los evaluados únicamente durante el decimocuarto día de cultivo.
En la tabla 3 se registran los datos obtenidos del efecto fungistático de los tratamientos a las diferentes concentraciones. Hay que tomar en cuenta que mayor eficiencia mostrarán los resultados cuya media sea más cercana a uno.
Tabla
3.
Efecto fungistático (%) de los productos de síntesis química en el control de Dactylonectria torresensis en mora de castilla
|
Fungicida
|
Dosis
|
|
1 ppm
|
10 ppm
|
100 ppm
|
|
Carbendazim
|
1±0.00 D
|
1±0.00
E
|
1±0.00 C
|
|
Azoxystrobin
|
1±0.00 D
|
1±0.00
E
|
1±0.00 C
|
|
Propiconazol
|
0.71±0.03 C
|
0.82±0.04 D
|
1±0.00 C
|
|
Difeconazol
|
0.58±0.04 B
|
0.74±0.05 CD
|
1±0.00 C
|
|
Penconazol
|
0.53±0.05 B
|
0.67±0.05 C
|
1±0.00 C
|
|
Benomil
|
0.21±0.06 A
|
0.67±0.05 C
|
1±0.00 C
|
|
Himexazol
|
0.22±0.04 A
|
0.34±0.05 B
|
0.67±0.05 B
|
|
Metalaxil
|
0.17±0.07 A
|
0.14±0.10 A
|
1±0.00 C
|
|
Thiabendazole
|
0.15±0.10 A
|
0.63±0.13 C
|
1±0.00 C
|
|
Fosetyl Aluminio
|
0.1±0.09 A
|
0.16±0.05 A
|
0.18±0.09 A
|
Como se puede apreciar en la Tabla 3, la eficiencia fungistática está liderada por los productos Carbendazim y Azoxystrobin, los cuales, independientemente de las dosis a las cuales fueron aplicados, muestran un valor de media de 1±0.00; mientras que los fungicidas Himexazol y Fosetil Aluminio son los agroquímicos que tienen medias más bajas en todos los tratamientos evaluados.
3.2. Resultados de la evaluación del efecto fungistático: productos de síntesis orgánica
Asimismo, los datos se tomaron en el decimocuarto día de incubación. Los resultados obtenidos en las mediciones se los puede ver en la Tabla 4:
Tabla
4.
Efecto fungistático (%) de los productos de síntesis orgánica en el control de Dactylonectria torresensis en mora de castilla
|
Fungicida
|
Dosis
|
|
100 ppm
|
200 ppm
|
300 ppm
|
|
Extracto de
mirtáceas
|
0.8±0.00 C
|
0.9±0.00 C
|
1±0.00 D
|
|
Extracto de ajo
|
0.14±0.05 A
|
0.14±0.05 A
|
1±0.00 D
|
|
Sulfato cúprico
pentahidratado
|
0.82±0.04 C
|
0.8±0.00 C
|
0.85±0.05 C
|
|
Aceite de neem
|
0.33±0.05 B
|
0.31±0.03 B
|
0.34±0.05 B
|
|
Extracto de tomillo
|
0.15±0.05 A
|
0.17±0.07 A
|
0.17±0.07 A
|
Se resalta como resultado de interés que el extracto de mirtáceas refleja una media cercana a uno en todas las dosis evaluadas y alcanza un valor máximo de 1±0.00 en la dosis de 300 ppm. Respecto al extracto de ajo, este muestra un valor de media de 1±0.00 solo en la dosis de 300 ppm, y en dosis menores no refleja un efecto fungistático eficiente. Para finalizar, el sulfato cúprico pentahidratado presenta medias con valores de entre 0.8 y 0.85 que pueden considerarse aceptables en la eficiencia del control fungistático del hongo.
3.3. Resultados de la evaluación de la concentración de los productos frente a la esporulación
Como primer resultado, se presenta que el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) representadas por el número de conidias para el testigo absoluto estuvo dado por 1389400±95972.91.
Los resultados de la medición de esporulación de los diferentes tratamientos en estudio, sin embargo, mostraron gran variabilidad entre ellos. Las medias de la contabilización de UFC se registraron en la Tabla 5 para los tratamientos de los fungicidas de síntesis química y, en la Tabla 6, los tratamientos de síntesis orgánica.
Tabla
5.
Unidades formadoras de colonias (UFC) de Dactylonectria torresensis por efecto de los productos de síntesis química
|
Fungicida
|
Dosis
|
|
1 ppm
|
10 ppm
|
100 ppm
|
|
Benomil
|
65000.00±13674.79 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Carbendazim
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Fosetyl Aluminio
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Metalaxil
|
0.00±0.00 A
|
84400.00±7569.68 CDE
|
40800.00±2489.98 ABC
|
|
Thiabendazole
|
38600.00±2190.89 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Difeconazol
|
107600.00±42618.07 A
|
0.00±0.00 A
|
107600.00±42618.07 DE
|
|
Himexazol
|
134400.00±3646.92 E
|
131200.00±6978.54 E
|
11800.00±47058.47 DE
|
|
Propiconazol
|
21000.00±8124.04 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Penconazol
|
103000.00±41551.17 A
|
0.00±0.00 A
|
103000.00±41551.17 DE
|
|
Azoxystrobin
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
0.00±0.00 A
|
Tabla
6.
Unidades formadoras de colonias (UFC) de Dactylonectria torresensis por efecto de los productos de síntesis orgánica
|
Fungicida
|
Dosis
|
|
100 ppm
|
200 ppm
|
300 ppm
|
|
Extracto de mirtáceas
|
5.80E-11±0.00 A
|
1.20E-10±0.00 A
|
5.80E-11±0.00 A
|
|
Aceite de neem
|
60800±10756.39 A
|
58200±10084.4 A
|
57600±10945.32 A
|
|
Sulfato cúprico pentahidratado
|
298600±6228.96 B
|
300200±2558.44 C
|
300000±4123.11 B
|
|
Extracto de ajo
|
3.94E+04±2073.64 A
|
3.92E+4±836.66 A
|
0.00±0.00 A
|
|
Extracto de tomillo
|
502400±10454.66 C
|
207600±8876.94 B
|
69800±2387.47 A
|
Se puede observar que los tratamientos de síntesis químico pertenecientes al grupo estadístico A controlan de manera eficiente el crecimiento de unidades formadoras de colonias; mientras que en los fungicidas de síntesis orgánica el extracto de ajo induce a un conteo de esporulación de cero a una dosis de concentración de 300 ppm; por lo tanto, es un resultado óptimo para controlar las esporas del patógeno.
3.4. Resultado del cálculo de la concentración efectiva EC50
Este cálculo se lo aplicó en siete fungicidas de mayor eficacia comprobada en los resultados previamente expuestos: Benomil, Difeconazol, Penconazol, Propiconazol, Thiabendazole, extracto de mirtáceas y extracto de ajo. Como valor promedio del cálculo de EC50 de los fungicidas químicos, se obtuvo un valor de 55 ppm, sin que muestre diferencia significativa entre los resultados de sus pares. Los fungicidas orgánicos alcanzaron un valor promedio de EC50 de 2500 ppm.
4. Discusión
El crecimiento del micelio del patógeno en estudio estuvo influenciado por el factor tiempo, resultado similar a la premisa explicada por Ferro (2008), lo que permitió que se descarten los primeros resultados obtenidos al séptimo día de incubación del hongo y que se consideren los que fueron tomados el decimocuarto día de incubación.
Rego, Farropas, Nascimento, Cabral y Oliveira (2006) y Halleen, Fourie y Crous (2007) presentan evaluaciones previas para el uso de fungicidas de síntesis química en el control de Cylindrocarpon spp., lo que determina que los fungicidas Carbendazim (clorhidrato de carbendacima), Procloraz (N-propil-N-[2-(2,4,6-triclorofenoxi)etil]imidazol-1-carboxamida), Tebuconazol ((RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol) muestran eficiencia marcada en su control; lo que se pudo confirmar en esta investigación, en la cual se obtuvieron valores similares.
Benalcázar (2011) demuestra también en su estudio que los fungicidas Carberndazim más Tebuconazol inhiben el crecimiento micelial de Sphaeroteca pannosa en un 100 % de eficiencia. Este dato se utilizó de referente para comprobar su amplitud de eficiencia en el control fitosanitario con los agroquímicos utilizados en campo actualmente.
Los resultados del control fungistático de los tratamientos con productos de síntesis química demostraron que la eficiencia del control estuvo relacionada directamente proporcional con la concentración del tratamiento, lo que concuerda con los estudios de Viera (2002) y Benalcázar (2011), en los cuales se presenta que la eficiencia de los fungicidas sistémicos incrementaron su control en dosis altas; y donde los Benzimidazoles lideraron los resultados. Respecto del caso específico de control de Dactylonectria torresensis, el que presentó mayor eficacia fue el Carbendazim.
Para analizar el control de la esporulación, los resultados obtenidos en el estudio concuerdan de manera similar con los de Viera (2002), en cuanto a la existencia de fungicidas de síntesis químicas que resultan ineficientes para controlar la esporulación, premisa que se evidencia en las tablas de resultados. Esto es fundamental, pues la reproducción de patógenos puede ser muy virulenta si no existe control efectivo, y, por lo tanto, la aplicación de los productos químicos en los campos para controlar el patógeno se incrementa sin obtener un resultado favorable.
El potencial antifúngico de los productos de síntesis orgánica que fueron seleccionados para este estudio basa su eficacia en los estudios de Farag (1989) y Nychas (1995). Los autores atribuyen esta característica a la presencia de compuestos monoterpénicos y fenólicos, que pueden tener la capacidad de atacar a la membrana del citoplasma del hongo y afectar de manera sustancial a la capacidad selectiva de este, además de poder inactivar las enzimas responsables del desarrollo fúngico.
En contraste con los estudios de Hernández, Bautista y Velázquez (2007), Müller-Riebau, Berger y Yegen (1995) y Plotto, Roberts y Roberts (2003), quienes presentan en sus estudios la eficiencia en el control de Alternaria arborescens, Botrytis cinérea, Phytopthora capsici y Rhizopus stolonifer con el extracto de tomillo (Timol), para este estudio, la utilización del mismo producto para controlar el Dactylonectria torresensis no fue efectiva. Esto se evidenció con los valores obtenidos tanto en el cálculo de inhibición fungistática como en el conteo de unidades formadoras de colonias, en el que se obtuvo valores inferiores a los de otros tratamientos como los desarrollados a base de extracto de mirtáceas y de extracto de ajo.
Al relacionar los resultados obtenidos entre la eficiencia del producto de síntesis química con el producto de síntesis orgánica, existen diferencias significativas. Sin embargo, se destaca que existen dos productos orgánicos relevantes que actúan de manera considerable sobre el efecto inhibitorio del fitopatógeno en estudio: el extracto de mirtáceas y sulfato cúprico pentahidratado. Adicionalmente, en los resultados obtenidos en el estudio del efecto sobre la esporulación del hongo, el extracto de ajo también mostró resultados favorables.
5. Conclusiones y recomendaciones
Se concluye que sí existen alternativas de productos de síntesis orgánica que puedan controlar eficientemente el crecimiento y esporulación de Dactylonectria torresensis en laboratorio; estos son el extracto de mirtáceas, el sulfato cúprico pentahidratado y el extracto de ajo.
Los resultados obtenidos en esta investigación presentan un panorama esperanzador en cuanto al desarrollo de métodos amigables con el ambiente, que puedan ser utilizados en campo con el fin de disminuir el uso de agentes nocivos para la salud y aportar a la producción limpia de alimentos.
Se recomienda desarrollar investigaciones en campo sobre la efectividad del uso de los productos mencionados, así como también se sugiere ampliar las opciones de dosis de aplicación para que se pueda considerar con datos más certeros el cálculo del EC50.
